ESPECTROFOTOMETRIA

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

La absorción de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.

  LEYES DE ABSORCIÓN

Cuando un haz de luz pasa a través de un medio, se registra una cierta pérdida de intensidad, debido a la absorción por parte de la sustancia.

Se llama “TRANSMITANCIA (T)” a la relación entre la luz incidente y la luz transmitida:

T = I_s / I₀  ;    %T = (I_s / I₀ ) x 100.

Se puede perder intensidad por la interacción con la cubeta o el solvente. Para evitar este error se hace una primera medida con una solución de referencia o BLANCO, que contiene todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir. Todas las medidas que se hagan con posterioridad serán referidas a esta medida inicial y se harán en la misma cubeta que se utilizó en la medida del blanco.

   La Transmitancia se usa poco, se emplea más la Absorbancia (A) porque la relación entre A y la concentración de una solución es directamente proporcional y la de la T es inversamente proporcional.

La relación entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente:

        Si el %T = 100                A = 2-log T = 2-log 100 = 0

        Si el %T = 0                    A = 2-log 0 = ¥

En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el aparato lo que mide realmente es %T que luego transforma a absorbancia.

LEY DE BEER

“La absorbancia de una solución es directamente proporcional ala concentración y a la longitud del paso de la luz”.

     A = e . b. c

Siendo:

A: absorbancia. No tiene unidades.

e: el coeficiente de extinción molar, también llamado coeficiente de absorción. Es constante para un compuesto dado siempre que se fijen condiciones de longitud de onda, de pH, de temperatura, de solventes, etc. Sus unidades son 1/ (mol/cm).

b: es la longitud de paso de la luz, en cm.

c: es la concentración del absorbente. Se mide en mol/L.

La aplicación práctica de la Ley de Beer es, que conociendo la absorbancia de una sustancia podemos averiguar su concentración y esto lo podemos hacer de dos formas:

1.        Por comparación con una solución conocida: si tenemos 2 soluciones, una problema (P) y una estándar (S), podemos establecer la siguiente relación matemática entre ellas: 

2.       A través de una curva de calibración: la curva de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentración (eje de abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus A, construyéndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su concentración se averigua por interpolación de las A de las soluciones problema en la curva de calibración. 

·           Empleo de los Factores de Calibración: Para reactivos estables y sistemas fotométricos estables, este factor se puede mantener constante, siendo sólo necesario ensayar las muestras problema multiplicando la A resultante por el factor F.

4.  ESPECTROFOTÓMETRO

Se distinguen dos tipos de aparatos:

·  Fotómetro o Colorímetro: se caracterizan porque utilizan filtros que solo permiten el paso de una determinada longitud de onda.

·  Espectrofotómetros: utilizan cromadores. Con ellos se obtiene un haz de luz monocromático cuya longitud de onda se varía a voluntad. Los monocromadores pueden ser de dos tipos: prismas y redes de difracción.

   

·  Precauciones:

-   Las subidas y bajadas bruscas de tensión producen sufrimiento de la lámpara y cambios en las lecturas de la Absorbancia.

-   La lámpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para que funcione bien el aparato.

2. Rendija de entrada: tiene como función reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema de selección de longitud de onda.

3. Monocromadores. Pueden ser:

-           Prismas: son fragmentos con forma de cuña de un material que permite el paso de la luz. Ej. De vidrio para trabajar en el espectro visible o cuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano.

-   Redes de difracción: son un gran número de líneas paralelas situadas a distancias iguales entre sí y son hendiduras sobre un vidrio o una superficie metálica. Cada una de estas hendiduras se comporta como un pequeño prisma.

4. Rendija de salida: tiene como función impedir que la luz difusa atraviese la cubeta de la muestra, que provocaría desviaciones a la Ley de Beer.

5. Cubeta: es el recipiente donde se coloca la muestra para la medición. Pueden ser de distintos tipos y tamaños (cuadradas, rectangulares, redondas). Se obtienen mejores resultados usando cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan cubetas redondas se deben marcar e introducir en el aparato siempre en la misma posición. Suelen estar fabricadas en vidrio o en plástico.

6. Detector. Puede ser de dos tipos:

·    Fotocélulas o células fotovoltaicas:

Es una lámina de Cobre sobre la que se extiende una capa de Selenio o de Óxido de Cobre. A ésto se le conoce como semiconductor. Sobre el semiconductor hay una capa de metal transparente que sirve de electrodo. La luz incide sobre el Selenio y éste desprende electrones, que pasan a la placa de Cobre originando una diferencia de potencial por existir carga negativa sobre el Cobre y positiva sobre el Selenio. El conjunto se conecta a un amperímetro que señala el paso de corriente.

Características: son resistentes; económicas; sensibles desde el ultravioleta hasta los 1.000 nm. de longitud de onda; no se requiere batería externa, ni vacío,...; la corriente producida es directamente proporcional a la Energía que llega y tienen “efecto fatiga”, es decir, que presentan una subida inicial de corriente, que luego decrece progresivamente hasta el equilibrio. Por eso hay que esperar entre 30-60 segundos entre una lectura y otra.

·  Fototubos multiplicadores:

Un fototubo multiplicador es un tubo que contiene un cátodo que emite electrones de forma proporcional a la Energía que incide sobre él. Tiene un ánodo que recoge los electrones y la corriente se multiplica varias veces al chocar los electrones sobre sucesivos ánodos que van teniendo un voltaje superior al precedente. La señal se amplifica en cientos o miles de veces.

Características: el tiempo de respuesta es muy rápido, no tienen “efecto fatiga” tan altos como la anterior y son muy sensibles.

7. Medidor: son sistemas de lectura de la Energía eléctrica que recoge el detector y que puede ser lectura directa (se utiliza una célula fotovoltaica) o puede ser amplificadores de señal como en el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan lectura digital y cálculos automáticos de concentraciones con relación a las curvas de calibración.

perso.wanadoo.es/sergioram1/espectrofotometria.htm